南京林业大学学报(自然科学版) ›› 2021, Vol. 45 ›› Issue (3): 79-86.doi: 10.12302/j.issn.1000-2006.202009006
收稿日期:
2020-09-02
修回日期:
2021-02-22
出版日期:
2021-05-30
发布日期:
2021-05-31
基金资助:
GE Baozhu(), XU Qiang, CHEN Yingnan*(
)
Received:
2020-09-02
Revised:
2021-02-22
Online:
2021-05-30
Published:
2021-05-31
摘要:
【目的】山新杨(Populus davidiana×P. bolleana)是林木基因工程育种基础和应用研究的良好材料;以山新杨蔗糖合酶基因(PdbSUS)为例研究聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)过程介导的重组现象,在此基础上区分每一个PdbSUS基因的两种单倍型,为后续研究提供准确的序列信息,并为判断木本植物基因真实的单倍型遗传信息提供参考。【方法】分别采集番茄(Lycopersicon esculentum)和山新杨新鲜嫩叶,以番茄基因组为内参,利用流式细胞仪测定山新杨基因组大小及其倍性水平。参考毛果杨(P. trichocarpa)蔗糖合酶序列设计引物,分别以山新杨基因组DNA和cDNA为模板进行同源克隆,将PCR扩增产物回收纯化,连接测序载体并转化大肠杆菌感受态细胞,挑取阳性克隆进行菌液PCR验证,将整合有外源片段的转化子进行一代测序。利用SnapGene及DNAMAN软件对测序结果进行分析比对。【结果】山新杨为二倍体植物,获得了7个PdbSUS基因的全长序列,并分别在基因组和转录水平鉴定出每个基因的两种单倍型序列。同时,检测到PCR介导的重组现象并通过限制性酶切多态性(RFLP)进行了验证。在测序的209个克隆中,发现有18个含有嵌合产物,占比8.6%,不同基因产生嵌合产物的概率为0~33.3%。检测到的嵌合产物均来自同一个位点的不同等位基因之间发生重组,未发现不同蔗糖合酶基因之间发生重组的现象。【结论】PCR介导的重组是PCR反应过程中能够衍生重组分子的一种高频事件,该现象可能是由于引物延伸不完全或聚合酶模板转换导致。在利用PCR技术克隆木本植物或其他基因组杂合度较高物种的基因时,需识别产物中重组分子才能够准确区分单倍型的遗传信息。
中图分类号:
葛宝柱,徐强,陈赢男. 山新杨蔗糖合酶基因PCR介导的重组现象研究[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2021, 45(3): 79-86.
GE Baozhu, XU Qiang, CHEN Yingnan. The phenomenon of PCR-mediated recombination by using SUS genes of Populus davidiana×P. bolleana[J].Journal of Nanjing Forestry University (Natural Science Edition), 2021, 45(3): 79-86.DOI: 10.12302/j.issn.1000-2006.202009006.
表1
扩增山新杨PdbSUS基因全长序列的引物序列及延伸时间"
项目 item | 基因名称 gene name | 引物 primer (5'-3') | 预期产物长度/bp expected amplicon length | 延伸时间/min extending time | |||
---|---|---|---|---|---|---|---|
基因组DNA全长 genomic DNA full length | PdbSUS1 | F: GAATAGTGTGGTTTCTCTG | 4 998 | 4.0 | |||
R: CCGTGTTTCCTCCATTTCTTCAGTT | |||||||
PdbSUS2 | F: CCTTTTGTTATGGAAACCTATTG | 5 570 | 4.5 | ||||
R: GGAGGATTTGTAAAGAACAGTGC | |||||||
PdbSUS3 | F: AGTGACAGTTTCCCAAT | 6 000 | 5.5 | ||||
R: TGTGATAGTGCTGCGTCTGA | |||||||
PdbSUS4 | F: GACCCTTTTCTGTTATCATTCGTT | 4 727 | 4.5 | ||||
R: ATCAGCCTAGTTAGTTTCCTTTCTTT | |||||||
PdbSUS5 | F: CGTATCAGGATTTCCAGCAGAGG | 3 187 | 3.0 | ||||
R: ATACAATGTGCTCCCGATGAAAT | |||||||
PdbSUS6 | F: TTGCGAGCACGGAAAGGA | 4 541 | 4.5 | ||||
R: GAGGAGAGAAGAAGCCGC | |||||||
PdbSUS7 | F: TCAGGGTGCCATTTAGGGTAGA | 2 263 | 2.0 | ||||
R: GAGCAGGTGAAAGTAGAGGA | |||||||
项目 item | 基因名称 gene name | 引物 primer (5'-3') | 预期产物长度/bp expected amplicon length | 延伸时间/min extending time | |||
cDNA全长 cDNA full length | PdbSUS1-c | F: ATGGCTGAACGTGCTCTTAC | 2 613 | 2.5 | |||
R: TCACTCCTTAGTCAAAGGAA | |||||||
PdbSUS2-c | F: ATGGCTGCACTTACTCGT | 2 412 | 2.5 | ||||
R: TTACTCGATAGTCAAAGGAACAGAATC | |||||||
PdbSUS3-c | F: ATGGCAAACCCTAAGCTTGA | 2 436 | 2.5 | ||||
R: TTAATGCCGGTCATCGATTG | |||||||
PdbSUS4-c | F: ATGGCTTCTGCACCAGTCCT | 2631 | 2.5 | ||||
R: TTATGGACTCCAGCCTTCATCTCTG | |||||||
PdbSUS5-c | F: ATGAGGTTGCTTTCTGAATCACTTCAA | 1 737 | 2.0 | ||||
R: CTACTTTGTCTGCTGCTTCCTG | |||||||
PdbSUS6-c | F: ATGGCAACCTTGAAGAGGTCTGA | 2 472 | 2.5 | ||||
R: TTAAGTAACGTCAGGTGGCGC | |||||||
PdbSUS7-c | F: ATGGCTGGTAAACTTGGGGT | 1 251 | 1.0 | ||||
R: TTAAGCTCCGAAAAACTTCTGCCA |
表2
山新杨蔗糖合酶基因测序结果统计"
基因名称 gene name | 预期产物 长度/bp expected amplicon length | 实际产物长度/bp actual amplicon length | 总测序克隆数 total number of sequenced clones | 含嵌合 产物克隆数 number of clones with chimeric products | 单倍型数目 number of genotypes | |
---|---|---|---|---|---|---|
单倍型Ⅰ Haplotype Ⅰ | 单倍型Ⅱ Haplotype Ⅱ | |||||
PdbSUS1 | 4 998 | 3 955 | 3 935 | 20 | 3 | 5 |
PdbSUS2 | 5 570 | 4 511 | 4 510 | 12 | 4 | 4 |
PdbSUS3 | 6 000 | 5 463 | 5 462 | 13 | 0 | 2 |
PdbSUS4 | 4 727 | 4 695 | — | 16 | 0 | 1 |
PdbSUS5 | 3 187 | 3 186 | 3 189 | 14 | 3 | 4 |
PdbSUS6 | 4 541 | 4 543 | 4 556 | 16 | 0 | 2 |
PdbSUS7 | 2 263 | 2 274 | 2 274 | 13 | 2 | 4 |
PdbSUS1-c | 2 613 | 2 418 | 2 418 | 17 | 0 | 2 |
PdbSUS2-c | 2 412 | 2 412 | 2 412 | 10 | 2 | 4 |
PdbSUS3-c | 2 436 | 2 436 | 2 436 | 8 | 1 | 3 |
PdbSUS4-c | 2 631 | 2 769 | 2 769 | 19 | 0 | 1 |
PdbSUS5-c | 1 737 | 1 923 | 1 923 | 18 | 2 | 4 |
PdbSUS6-c | 2 472 | 2 661 | 2 583 | 18 | 0 | 2 |
PdbSUS7-c | 1 251 | 1 251 | 1 251 | 15 | 1 | 3 |
总数total number | — | — | — | 209 | 18 | — |
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