【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla × B. pendula)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示: Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件下培养25 d左右可获得幼嫩愈伤组织,以其为受体在轰击距离为12 cm、7 584.5 kPa条件下,用包被Cas9蛋白与gRNA(RNP)金粒进行轰击,随后经过分化培养及继代培养可获得叶色呈现黄绿色的glkc突变株,测序结果显示,该突变株的BpGLK1基因产生18 bp的纯合缺失突变。【结论】利用CRISPR/Cas9编辑技术可实现无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变。
【目的】为培育更多的彩叶树种,以满足人们对城市园林绿化美景的追求,采用分子设计育种手段创制黄叶裂叶桦(Betula pendula ‘Dalecarlica’)。【方法】以裂叶桦茎段为材料,通过农杆菌介导法将前期构建的35S::BpGLK1-RNAi载体导入其基因组中,进而对获得的抗性转基因株系进行DNA水平及mRNA的检测,同时测定裂叶桦BpGLK1干扰表达株系的叶色、光合色素及光合参数、株高生长、基因表达特性。【结果】实验共获得8个抗除草剂再生转化株系,分子检测表明,BpGLK1干扰序列分别整合于8个转基因株系基因组中,且这些转基因株系中的BpGLK1相对表达量均呈下调表达。对移栽田间的1年生转基因株系叶色、叶色参数和叶绿素相对含量调查发现,8个转基因株系中RE1—RE5为黄叶株系,RE6—RE8为绿叶株系;相对于WT及绿叶株系,黄叶株系叶色参数L*及b*显著升高,叶绿素a及叶绿素b含量降低,但叶绿素a与b的比值呈上升趋势。转基因株系与野生型(WT)株系相比净光合速率(Pn)没有显著差异。株高分析显示,4个转基因株系显著高于WT株系;3个株系与WT株系差异不显著。基于RNA-Seq找到的显著下调的差异基因BpCOL、BpLCHⅡ、BpPDS和BpFKBP的qRT-PCR分析显示,上述4个基因在RE1—RE3中均呈显著下调表达趋势。【结论】导入的GLK1干扰靶序列能够降低转基因裂叶桦BpGLK1基因表达量,并获得了在园林绿化中具有潜在应用价值的黄叶裂叶桦。
【目的】创制毛果杨(Populus trichocarpa)LBD12(lateral organ boundaries domain 12)转录因子的过量表达植株,分析表型特征,初步探究PtrLBD12转录因子在毛果杨木材形成中的生物功能。【方法】基于前期的研究,筛选出了木材形成关键调控因子PtrbHLH186调控的下游转录因子PtrLBD12,通过基因克隆获得PtrLBD12基因;创制PtrLBD12过量表达毛果杨植株,测定并统计生长30、60、90 d毛果杨野生型和过表达植株的生长指标;对生长120 d的转基因及野生型植株各茎节进行石蜡切片、化学染色观察及不同细胞类型的统计分析;通过定量PCR测定过表达PtrLBD12基因对22个木质素单体合成酶基因表达水平的影响。【结果】获得毛果杨PtrLBD12过表达植株;与野生型相比,转基因植株的株高、地径等生长指标水平明显降低;纤维和导管细胞的数量显著增多,导管细胞的孔径减小,形成层细胞的形态结构无明显变化;木质素沉积水平增加,木质化程度增强;PtrLBD12的过量表达促进了木质素合成酶基因的表达。【结论】LBD12转录因子在毛果杨木材形成过程中发挥重要的调控作用,可调节木质素单体合成酶基因的表达,改变木质素沉积方式。此外,该基因也可以改变木质部细胞形态结构,影响植株生长发育。
【目的】针对调控裂叶桦( Betula pendula ‘Dalecarlica’)叶形的基因进行初步定位,筛选并注释可能的候选基因,为后续的验证实验和机理研究奠定基础。【方法】以来自1株裂叶桦母树的24株子代个体为试验材料,其包括了正常叶、浅裂叶、深裂叶等类型,扫描每单株的5个叶片,使用衡量叶片不规则度的指标计算每株个体的叶形不规则度,分析个体之间的差异显著性,测定每单株RNA-Seq数据,分析其中的SNP/InDel信息,并结合叶片不规则度进行关联分析,划定关联区。根据RNA-Seq数据分析实验材料全基因组的基因表达量,计算基因差异显著性,继而挑选出关联区中的差异基因。将关联区中受关联性SNP影响的基因和差异表达的基因作为候选基因,使用在线数据库进行基因功能注释。【结果】试验群体叶形不规则度的变异系数达60.51%,满足关联分析的需求。对实验群体全基因组中1 367 359个SNP/InDel标记的关联分析结果显示,裂叶桦叶形调控基因所在的关联区长9.18 MbP,包含400个基因,关联区内61个关联性SNP影响了17个基因的编码。基因表达量分析结果显示,关联区中有25个基因在不同叶形桦树之间存在极显著差异(P<0.01)。对上述候选基因进行功能注释,根据注释结果,预测其中3个转录因子和1个生长素转运蛋白可能是调控裂叶桦叶形的关键基因。【结论】调控裂叶桦叶片分裂性状的基因定位在7号染色体7466344—16651477的区间,包含候选基因40个。根据基因注释结果,建议后续研究重点针对其中3个转录因子和1个生长素外排体基因开展。
