【目的】探究在自然条件下松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)与不同抗病力松树家系互作后,是否对松材线虫的致病力和繁殖力产生影响,并分析致病力差异明显的松材线虫虫株与松树互作后其细胞色素 P450(Cytochrome P450)家族相关基因表达是否发生变化。【方法】对前期引自日本的抗松材线虫病赤松(Pinus densiflora)和黑松(P. thunbergii)基因库松树进行田间发病状况调查,发现不同松树家系的抗病能力存在显著差异。对松树基因库中各家系枯死木取样,经松材线虫自动化分子检测后,将确定为松材线虫致死的5个赤松家系和5个黑松家系样木进行线虫分离,采用单异活体培养共获得10个松材线虫虫株,检测这些虫株的致病力和繁殖力,并收集其中4个致病力差异明显的松材线虫虫株,采用RT-qPCR技术检测其与黑松互作后的2个细胞色素P450相关基因相对表达量差异。【结果】同一地块同一树种中抗病能力越强的家系,获得的松材线虫虫株在单异活体培养下繁殖量越低,相反抗病能力越弱的家系,获得的松材线虫繁殖量越高;将各虫株接种2年生黑松发现,5个黑松家系病死木中获得的线虫虫株致病力测定结果与松树家系的抗性强弱呈正相关,其中抗病能力最强的家系34病死木中获得的松材线虫虫株JYK-34的致病力最强。而赤松家系的抗性强弱与松材线虫的致病力并不呈正相关,其中来自抗病能力较强的家系18病死木分离的松材线虫虫株JYK-18的致病力却较弱;与对照线虫相比,致病力差异明显的4个虫株与2年生黑松苗互作30 d后,它们的2个细胞色素P450相关基因BxCYP33C4和BxCYP33C9的相对表达量增长倍数与虫株的致病力强弱呈正相关,各虫株依次为JYK-34>JYK-17>JYK-18>JYK-31。【结论】松材线虫繁殖力的分化在赤松和黑松两个树种不同抗病家系中规律相同;抗性松树基因库中同一地块不同抗病力松树分离的松材线虫的致病力并非单一类型,存在致病力差异的虫株;松材线虫细胞色素P450相关基因BxCYP33C4和BxCYP33C9不仅参与松材线虫与松树的互作过程,还是松材线虫重要的致病相关基因。
【目的】建立马尾松(Pinus massoniana)愈伤组织抗松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)病评价体系,筛选抗性马尾松细胞系。【方法】以马尾松不同胚性愈伤组织为试验材料,以黑松(P. thunbergii)和湿地松(P. elliottii)胚性愈伤组织作对照,接种无菌松材线虫,从接种线虫后愈伤组织外观形态、细胞结构和细胞活力变化以及线虫繁殖量4个方面探讨马尾松胚性愈伤组织对松材线虫的抗性。【结果】马尾松不同细胞系胚性愈伤组织之间抗病性差异显著。细胞系GX19-1-2和GX20-3-3显示出最高的抗性,接种无菌松材线虫10 d后外观轻微黄化,TTC染色结果为红色,显示其细胞保持较好活力;再分离线虫数量分别为(4 200±306)条和(5 933±1 392)条,显著低于湿地松2个细胞系(1907-9和1927-1),抗病性高于湿地松的1907-9和1927-1;GX20-3-8次之,线虫数量为(11 133±2 728)条;细胞系GX20-1-1接种无菌松材线虫后严重褐化、水渍化,TTC染色结果显示其细胞已完全失去活力,再分离线虫数量为(24 800±2 411)条,易感程度介于黑松细胞系1337和36-2之间。【结论】构建了基于愈伤组织的松树抗松材线虫评估体系,并筛选出2个具有较高抗性水平的马尾松细胞系GX19-1-2和GX20-3-3。这不仅为大规模筛选抗松材线虫病新种质奠定了基础,还为深入探究寄主松树-病原松材线虫之间相互作用的机制提供了新的研究平台。
【目的】克隆松墨天牛(Monochamus alternatus)谷胱甘肽S转移酶(glutathione S-transferases, GST)相关基因,明确GST基因在松墨天牛响应高温胁迫中的效用,为探究亚热带地区松墨天牛的耐热分子机制提供理论依据。【方法】克隆3条松墨天牛GST基因,结合DNAMAN 9.0、I-TASSER等软件分析松墨天牛GST基因的结构特征;利用qRT-PCR技术测定分析松墨天牛成虫和4龄幼虫在不同高温、不同处理时长后GST基因的相对表达量;通过纸盘扩散法验证3条松墨天牛GST基因在保护机体免受氧化应激中的作用。【结果】克隆3条松墨天牛GST基因的cDNA序列,分别命名为MaltGSTe1、MaltGSTe2和MaltGSTt1。MaltGSTe1与MaltGSTe2均属于GST的Epsilon家族,MaltGSTt1属于GST的Theta家族。3条GST基因三维蛋白结构具有指示性结构特征,属于胞质型GST。松墨天牛4龄幼虫在高温胁迫下MaltGSTe1、MaltGSTe2和MaltGSTt1的相对表达量均出现显著变化,MaltGSTe2相对表达水平上调幅度最大;MaltGSTt1在松墨天牛雄虫体内相对表达量出现明显下调;异源表达3条GST基因蛋白的大肠杆菌表现出较强的抗氧化能力,其中,MaltGSTe2具有更强的抗氧化能力。【结论】克隆获得3条松墨天牛GST基因,发现高温胁迫可诱导GST基因表达量上调;纸盘扩散分析结果表明异源表达GST基因蛋白具有抗氧化能力,推测GST基因具有通过保护机体免受氧化应激来参与松墨天牛幼虫的高温胁迫响应机制。
